Le contrôle de l'expression du génome

Résumé en cinq points

Notions et mécanismes

Le problème posé

Des modifications de l'environnement cellulaire ou des signaux internes à la cellule influencent l'expression du génome. Un même génome peut ainsi donner des phénotypes variés.

Le vocabulaire doit être posé avec soin. Le transcriptome est l'ensemble des ARN transcrits et maturés présents dans une cellule à un instant donné. Le protéome est l'ensemble des protéines présentes dans cette cellule au même instant. Ces deux ensembles ne se déduisent pas l'un de l'autre. Le phénotype cellulaire, c'est-à-dire l'ensemble des caractères observables de la cellule, découle du protéome.

L'ensemble des contrôles transcriptionnels, post-transcriptionnels et post-traductionnels explique la diversité des transcriptomes et des protéomes. La logique du chapitre consiste donc à parcourir la chaîne d'expression et à identifier, à chaque étape, ce qui peut être réglé.

Le contrôle de l'initiation de la transcription

C'est la principale voie de contrôle de l'expression génétique, et celle sur laquelle le programme insiste le plus. L'argument est économique. Contrôler à la première étape évite de produire des molécules qui seraient ensuite détruites.

Le contrôle repose sur des interactions entre des séquences régulatrices de l'ADN et des protéines, facteurs de transcription et facteurs de remodelage de la chromatine.

Un facteur de transcription est une protéine qui interagit spécifiquement, d'une part avec une séquence d'ADN, d'autre part avec d'autres protéines. Cette double spécificité est le point clé. Un facteur de transcription possède donc au moins deux domaines fonctionnels, un domaine de liaison à l'ADN et un domaine d'interaction protéique. La reconnaissance de la séquence d'ADN se fait par complémentarité de forme et interactions faibles au niveau du grand sillon de la double hélice, sans ouverture de celle-ci.

Le programme limite l'étude structurale au motif bHLH, hélice-boucle-hélice basique, en lien avec les facteurs myogéniques repris en deuxième année. Dans ce motif, une région basique, riche en acides aminés chargés positivement, assure le contact avec l'ADN chargé négativement, et les deux hélices séparées par une boucle assurent la dimérisation avec un autre facteur. La conséquence fonctionnelle est importante. Ces facteurs agissent en dimères, et la nature du partenaire modifie le résultat. Un même facteur peut donc activer ou non selon ce qui est présent dans la cellule.

Un facteur peut agir positivement, en favorisant la formation ou la stabilité du complexe d'initiation, ou négativement, en la gênant.

La probabilité d'initiation de la transcription dépend de la combinaison de tous ces acteurs. Cette formulation combinatoire est essentielle. Elle explique qu'un nombre modeste de facteurs suffise à produire un très grand nombre de profils d'expression différents, et elle interdit de raisonner gène par gène avec un seul interrupteur.

Chromatine, méthylation et contrôle épigénétique

Le niveau de transcription est influencé par l'état de la chromatine et par la méthylation des bases de l'ADN.

Une chromatine très condensée rend le promoteur inaccessible aux facteurs de transcription et à l'ARN polymérase. Une chromatine décondensée le rend accessible. Des complexes de remodelage modifient cet état, et les histones peuvent porter des modifications chimiques qui favorisent l'une ou l'autre configuration. Le détail de ces modifications n'est pas exigible.

La méthylation de bases de l'ADN, principalement des cytosines, est généralement associée à une réduction de la transcription.

Le point important est que ces modifications sont transmissibles. Elles se maintiennent au cours des divisions cellulaires et peuvent donc se propager dans une lignée sans que la séquence de l'ADN soit modifiée. C'est la base du contrôle épigénétique. L'ensemble de ces modifications transmissibles constitue l'épigénome.

Il faut retenir la définition par ses deux propriétés conjointes. Une marque épigénétique modifie l'expression, et elle est héritable au fil des divisions, sans changement de séquence.

Les contrôles post-transcriptionnels

Une fois le transcrit produit, plusieurs leviers subsistent.

La maturation elle-même est un levier. L'épissage alternatif permet de produire des ARN messagers différents à partir d'une même unité de transcription, selon le type cellulaire ou le stade.

La stabilité du transcrit en est un autre. La coiffe et la queue polyadénylée protègent l'ARN messager. Sa demi-vie détermine combien de fois il pourra être traduit. Deux gènes transcrits au même rythme peuvent ainsi donner des quantités de protéines très différentes.

L'exportation hors du noyau constitue un troisième levier, puisqu'un ARN retenu dans le noyau n'est pas traduit.

L'interférence par ARN est le mécanisme post-transcriptionnel majeur retenu par le programme. Les grandes étapes, sans aucun détail moléculaire, sont les suivantes. Un ARN interférent, court, s'apparie par complémentarité de bases à un ARN messager cible. Cet appariement aboutit soit à l'inhibition de la traduction de l'ARN messager, soit à l'activation d'une endonucléase qui hydrolyse cet ARN messager. Dans les deux cas, la protéine n'est pas produite, alors que le gène a bien été transcrit.

Ce mécanisme a un intérêt expérimental direct. En introduisant un ARN interférent choisi, on éteint spécifiquement l'expression d'un gène et on observe les conséquences phénotypiques.

Les contrôles post-traductionnels

La protéine produite n'est pas nécessairement active.

Le repliement peut être requis et assisté par des chaperonnes. Le clivage d'un précurseur inactif libère une forme active, ce qui permet une activation rapide sans nouvelle synthèse. La phosphorylation réversible, par des kinases et des phosphatases, fait basculer une protéine entre forme active et forme inactive en quelques secondes. La glycosylation intervient dans la maturation des protéines membranaires et sécrétées. L'adressage détermine le lieu d'action. Enfin, la dégradation contrôlée fixe la durée de vie de la protéine.

Il faut associer à chaque niveau de contrôle une échelle de temps. Le contrôle transcriptionnel est lent, de l'ordre de la dizaine de minutes à l'heure, mais durable. Le contrôle post-traductionnel est rapide, de l'ordre de la seconde à la minute, et réversible. Une cellule utilise les deux pour des usages différents.

Du contrôle au phénotype

La diversité des ARN et des protéines produits à un instant donné est à l'origine du phénotype des cellules et des organismes.

La différenciation cellulaire s'explique par ce raisonnement. Toutes les cellules d'un organisme possèdent le même génome, mais expriment des jeux de gènes différents, sous l'effet de combinaisons de facteurs de transcription différentes, elles-mêmes mises en place par l'histoire de la cellule et par les signaux reçus de son environnement. Les marques épigénétiques stabilisent ensuite cet état et le transmettent aux cellules filles, ce qui rend la différenciation durable.

Exemples et objets de référence

L'exemple de référence du contrôle épigénétique imposé par le programme est le gène FLC chez Arabidopsis thaliana. Ce gène code un facteur de transcription qui réprime la floraison. Chez une plante non exposée au froid, FLC est exprimé et la floraison est bloquée. Une exposition prolongée au froid de l'hiver, la vernalisation, entraîne une condensation progressive de la chromatine au niveau de ce gène et la mise en place de modifications des histones qui réduisent puis éteignent son expression. Cet état réprimé est conservé après le retour à des températures plus élevées et transmis aux cellules filles au cours des divisions, ce qui permet la floraison au printemps.

Trois points doivent être explicitement reliés dans ce raisonnement. Une condition climatique, le froid prolongé. Un état de condensation de la chromatine. Un niveau d'expression génétique, et donc un phénotype, la floraison. Le caractère épigénétique tient à la persistance de l'état réprimé alors que la cause a disparu et que la séquence n'a pas changé.

L'exemple de référence en matière de facteur de transcription est le motif bHLH, présenté ici et réinvesti en deuxième année avec les facteurs myogéniques lors de la différenciation de la cellule musculaire striée squelettique.

Ordres de grandeur utiles. Le génome humain code de l'ordre de 20 000 protéines différentes par ses gènes, mais le nombre de protéines distinctes réellement produites est estimé bien supérieur, ce qui illustre le rôle de l'épissage alternatif et des modifications post-traductionnelles. Une cellule différenciée n'exprime qu'une fraction de ses gènes à un instant donné, typiquement de l'ordre de la moitié, dont une grande partie de gènes dits domestiques communs à tous les types cellulaires.

Schémas à savoir décrire en mots. Un promoteur avec le complexe d'initiation, l'ARN polymérase, et des facteurs de transcription fixés sur des séquences régulatrices proches et éloignées, avec des flèches d'effet positif et négatif. La même région dans deux états de chromatine, condensé et décondensé, avec les conséquences sur l'accessibilité. Le schéma de l'interférence par ARN, de l'appariement à l'hydrolyse ou au blocage de traduction.

Méthodes et savoir-faire

La logique commune de toutes les techniques du chapitre tient en une phrase. On détecte une molécule précise dans un mélange, grâce à un partenaire qui la reconnaît spécifiquement, après l'avoir séparée des autres. Le partenaire est une sonde nucléotidique pour les acides nucléiques, un anticorps pour les protéines.

Le Southern blot détecte une séquence d'ADN. On extrait l'ADN, on le coupe par des enzymes de restriction, on sépare les fragments par électrophorèse, on les transfère sur une membrane, et on révèle par une sonde nucléotidique marquée, complémentaire de la séquence recherchée. On conclut sur la présence, l'absence ou la taille d'une séquence dans le génome.

Le northern blot suit le même principe à partir des ARN. On conclut sur la présence et la quantité d'un ARN messager donné, donc sur la transcription d'un gène.

Le western blot suit le même principe à partir des protéines, la révélation se faisant par un anticorps spécifique. On conclut sur la présence et la quantité d'une protéine.

Le témoin de charge est un point de rigueur explicitement exigé. Il consiste à révéler en parallèle une molécule dont la quantité est supposée identique dans tous les échantillons, par exemple un ARN ou une protéine de gène domestique. Sans lui, une différence d'intensité entre deux pistes peut simplement venir d'une quantité de matériel déposée différente. On justifie donc toujours qu'un témoin de charge d'intensité comparable valide la comparaison.

L'hybridation in situ révèle une séquence d'acide nucléique sans détruire le tissu. Une sonde marquée est appliquée sur une coupe ou un embryon entier. Elle apporte une information de localisation, ce que les techniques précédentes ne donnent pas. Elle répond à la question où, pas à la question combien.

La puce à ADN permet de comparer des transcriptomes entiers. Des sondes correspondant à de nombreux gènes sont fixées en des positions connues d'un support. On applique les ARN de deux conditions, marqués différemment, et on lit la couleur ou l'intensité de chaque position. L'analyse attendue est qualitative, on conclut qu'un gène est plus exprimé dans une condition que dans l'autre.

La mutagenèse et la transgenèse servent à établir des liens de cause à effet. La mutagenèse aléatoire produit des mutations non ciblées, puis on sélectionne les individus au phénotype modifié et on cherche ensuite le gène touché. La mutagenèse ciblée modifie un gène choisi et observe le phénotype. La transgenèse introduit une séquence exogène dans un organisme et observe l'effet, ce qui permet aussi de tester une séquence régulatrice en la couplant à un gène rapporteur. Le programme limite la transgenèse à la transformation chez les bactéries.

Le raisonnement d'exploitation est toujours le même. On compare une condition test à un témoin qui ne diffère que par le paramètre étudié, on vérifie la validité de la comparaison par les témoins de charge, on décrit la différence observée, puis on l'interprète en termes de niveau de contrôle. Il faut résister à la tentation de conclure sur la protéine à partir d'un northern blot, ou sur la transcription à partir d'un western blot.

Ce qu'il faut savoir mobiliser en colle et à l'écrit

• Refaire le schéma d'une région promotrice avec facteurs de transcription activateurs et répresseurs, et expliquer la notion combinatoire de probabilité d'initiation.
• Placer sur la chaîne complète de l'expression les niveaux de contrôle, avec pour chacun un mécanisme et une échelle de temps.
• Exposer l'exemple du gène FLC en reliant explicitement froid, état de la chromatine, expression et floraison, et justifier que le contrôle est épigénétique.
• Définir transcriptome, protéome et épigénome sans les confondre, et dire pourquoi le protéome ne se déduit pas du transcriptome.
• Choisir la bonne technique devant une question donnée, et savoir dire ce qu'elle ne permet pas de conclure.
• Identifier et justifier un témoin de charge sur un blot, et refuser une conclusion quantitative en son absence.
• Décrire l'interférence par ARN en trois étapes, et expliquer son usage comme outil d'extinction ciblée d'un gène.
• Piège fréquent, dire qu'une cellule différenciée a perdu des gènes. Autre piège, confondre mutation et modification épigénétique, la première touchant la séquence, la seconde non.

Notions et mécanismes clés

• Génome : ensemble de l'information génétique d'une cellule. Il est identique dans toutes les cellules somatiques d'un organisme, aux mutations près.
• Transcriptome : ensemble des ARN présents dans une cellule à un instant donné. Il est variable dans le temps et selon le type cellulaire.
• Protéome : ensemble des protéines présentes à un instant donné. Il dépend du transcriptome sans s'en déduire.
• Épigénome : ensemble des modifications de la chromatine et de méthylation de l'ADN, transmissibles au fil des divisions, sans changement de séquence.
• Séquence régulatrice : portion d'ADN non codante, proche ou éloignée du promoteur, reconnue par un facteur de transcription.
• Facteur de transcription : protéine à double spécificité, pour une séquence d'ADN et pour d'autres protéines.
• Motif bHLH : région basique de contact avec l'ADN, puis deux hélices séparées par une boucle qui permettent la dimérisation.
• Probabilité d'initiation : fréquence à laquelle le complexe d'initiation se forme sur un promoteur. Elle résulte de la combinaison de tous les acteurs présents.
• Chromatine condensée ou décondensée : état qui conditionne l'accès des facteurs et de l'ARN polymérase au promoteur.
• Méthylation des cytosines : marque de l'ADN généralement associée à une répression de la transcription.
• Épissage alternatif : production de plusieurs ARN messagers différents à partir d'un même pré-messager.
• Demi-vie d'un ARN messager : durée au bout de laquelle la moitié des molécules est dégradée. Elle fixe le nombre de traductions possibles.
• Interférence par ARN : appariement d'un ARN court à un ARN messager cible, puis blocage de la traduction ou hydrolyse par une endonucléase.
• Modifications post-traductionnelles au programme : clivage, glycosylation, phosphorylation. Le repliement assisté par des chaperonnes et l'adressage s'y ajoutent comme étapes de maturation.
• Témoin de charge : molécule révélée en parallèle, de quantité supposée constante, qui valide la comparaison entre pistes.
• Mutagenèse aléatoire : du phénotype vers le gène. Mutagenèse ciblée : du gène vers le phénotype.
• Transgenèse : introduction d'une séquence exogène. Seule la transformation bactérienne est exigible.
• Gène rapporteur : gène dont le produit se détecte facilement (fluorescence, coloration), placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice à tester.

Chaînes de raisonnement

Même génome, phénotypes différents. Les cellules d'un organisme dérivent toutes du zygote par mitoses, donc elles portent le même génome. Elles expriment pourtant des jeux de gènes différents, parce qu'elles contiennent des combinaisons différentes de facteurs de transcription et des états de chromatine différents. Le protéome diffère donc, et avec lui le phénotype cellulaire.

Pourquoi la combinatoire change tout. Un promoteur porte plusieurs séquences régulatrices, et chaque facteur agit positivement ou négativement. Si une cellule dispose de quelques dizaines de facteurs, le nombre de combinaisons possibles est immense. On ne raisonne donc jamais avec un interrupteur unique, mais avec une probabilité d'initiation qui dépend de l'ensemble.

Du partenaire de dimérisation au résultat. Un facteur bHLH se fixe à l'ADN sous forme de dimère, et chaque monomère apporte sa région basique. Si le partenaire n'a pas de région basique, le dimère se forme mais ne se fixe plus. La présence d'un tel partenaire suffit donc à inactiver le facteur sans modifier ni son gène ni sa quantité.

Du froid à la floraison. Le froid prolongé entraîne la mise en place de modifications des histones et une condensation de la chromatine au niveau de FLC. La transcription de FLC chute, le répresseur de la floraison disparaît, la plante devient apte à fleurir. L'état réprimé persiste après le retour au chaud et se transmet aux cellules filles, ce qui signe le caractère épigénétique.

ARN présent ne veut pas dire protéine présente. Entre l'ARN messager et la protéine active s'intercalent l'exportation, la stabilité, l'interférence par ARN, la traduction, puis la maturation. Un ARN abondant peut donc donner peu de protéine, et une protéine abondante peut être inactive. Pour situer un contrôle, il faut mesurer à deux niveaux au moins et comparer.

De l'extinction à la fonction. On introduit un ARN interférent complémentaire de l'ARN messager d'un gène. La protéine disparaît, on le vérifie par western blot, et on observe le phénotype. Si le phénotype change et si un ARN interférent sans cible ne produit rien, on attribue la fonction au gène.

Contrôle lent et contrôle rapide. Une réponse transcriptionnelle exige transcription, maturation, exportation et traduction, donc des dizaines de minutes au moins. Une phosphorylation modifie une protéine déjà présente en quelques secondes. Une réponse immédiate à un signal est donc post-traductionnelle, une adaptation durable est transcriptionnelle.

Exemples et références à connaître

1. FLC chez Arabidopsis thaliana. Seul exemple exigible de contrôle épigénétique. Précision valorisée : la répression acquise par vernalisation est remise à zéro lors de la reproduction, si bien que chaque génération doit de nouveau passer un hiver. L'épigénétique se transmet donc ici entre cellules, pas entre générations.
2. Facteurs myogéniques bHLH, dont MyoD, réinvestis en deuxième année. Ils se dimérisent avec des partenaires ubiquitaires et se fixent sur de courtes séquences régulatrices appelées boîtes E. Certaines protéines HLH dépourvues de région basique capturent leurs partenaires et les inactivent. Exemple parfait d'effet du partenaire.
3. Calcitonine et CGRP. Le même gène donne une hormone dans la thyroïde et un neuropeptide dans certains neurones, par épissage alternatif. C'est l'exemple le plus simple d'un gène, deux produits.
4. Proinsuline. Clivée en insuline active et peptide C dans les vésicules de sécrétion. Exemple de clivage d'un précurseur inactif. Le peptide C sert d'ailleurs à doser la sécrétion réelle d'insuline.
5. Glycogène phosphorylase. Activée par phosphorylation en quelques secondes en réponse à un signal hormonal. Exemple de contrôle post-traductionnel rapide et réversible.
6. Fire et Mello, chez le ver Caenorhabditis elegans. L'injection d'ARN double brin éteint spécifiquement un gène, bien plus efficacement qu'un ARN simple brin. Découverte récompensée par un prix Nobel en 2006.
7. Témoins de charge usuels. Actine, tubuline ou GAPDH pour les western et northern blots. Les ARN ribosomiques colorés sur le gel pour un northern blot. Toujours des produits de gènes domestiques.
8. Ordres de grandeur. Environ 20 000 gènes codant des protéines chez l'être humain. Demi-vie d'un ARN messager eucaryote : de quelques minutes à plusieurs heures, voire davantage. Phosphorylation : la seconde. Induction transcriptionnelle visible sur un western blot : de l'ordre de l'heure.

Techniques

Exploiter un blot en quatre temps

Un, identifier la technique et donc la molécule détectée, ADN, ARN ou protéine. Deux, vérifier le témoin de charge piste par piste. Trois, décrire la différence de présence, d'intensité ou de taille. Quatre, conclure au bon niveau, et seulement à ce niveau.

Mini-exemple. Northern blot sur des cellules traitées ou non par une hormone. La bande de l'ARN du gène X est intense chez les cellules traitées, faible chez les témoins, et la bande de l'ARN d'actine est identique. Conclusion correcte : l'hormone augmente la quantité d'ARN messager de X. On ne peut pas dire que l'hormone augmente la transcription, puisqu'une stabilisation de l'ARN donnerait le même résultat. On ne peut rien dire de la protéine.

Choisir la technique devant une question

Présence ou taille d'une séquence dans le génome : Southern blot. Quantité d'un ARN : northern blot. Quantité ou taille d'une protéine : western blot. Localisation d'un ARN dans un tissu : hybridation in situ. Comparaison globale de deux transcriptomes : puce à ADN. Lien causal entre un gène et un phénotype : mutagenèse, transgenèse ou interférence par ARN.

Mini-exemple. On veut savoir dans quelles cellules d'un embryon un gène est transcrit. Le northern blot est inadapté, car il broie les tissus et perd la localisation. On choisit l'hybridation in situ avec une sonde complémentaire de l'ARN messager.

Le schéma bilan des niveaux de contrôle

Une ligne horizontale de gauche à droite : chromatine, transcription, maturation, exportation, ARN messager cytoplasmique, traduction, protéine, protéine active. Sous chaque étape, un mot pour le mécanisme de contrôle et un mot pour l'échelle de temps. Au-dessus, l'épigénome au début et la dégradation à la fin. Le correcteur vérifie que chaque niveau porte un exemple précis.

Plan de synthèse

Un plan qui suit la chaîne d'expression fonctionne toujours, mais il devient un catalogue si l'on ne hiérarchise pas. Gabarit conseillé : d'abord la transcription, voie principale, ensuite ce qui module la quantité de protéine, puis ce qui module son activité, enfin l'articulation de ces niveaux dans un exemple, différenciation ou floraison.

Sujets classiques traités

Choisis ton niveau. Difficulté indicative ; les exercices qui se suivent restent dans l'ordre.

Erreurs fréquentes